dsh-molbio-tools

面向 DeepSeek Harness 的零依赖分子生物学研究插件：序列分析、引物自动设计与检查、限制性酶切模拟、GenBank 解析与质粒图谱、qPCR 分析、文献助手与实验台计算。除文献检索与存储外全部为确定性纯计算；插件由纯 .mjs 文件构成，可随 agent preset 目录整体复制分发。

提供的工具（44 个，模型可调用）

序列分析

工具	功能
`molbio_reverse_complement`	反向互补 / 互补链（IUPAC 简并码，自动忽略空白与数字）
`molbio_gc_content`	整体 GC 含量 + 可选分窗口 GC 百分比
`molbio_translate`	1/2/3/-1/-2/-3 或六框翻译（3 套密码子表），ORF 查找
`molbio_restriction_sites`	内置 90+ 限制酶（v10 起含 IIS 型：BsaI/BsmBI/BbsI/BspQI/SapI/PaqCI/AarI/BtgZI/BsmFI/FokI 等，切点在识别位点外，显示标准 (N₁/N₂) 记法）位点搜索与酶切片段计算（线性/环状）
`molbio_enzyme_lookup`	v13 酶目录查询：按名称/识别位点/切点几何/突出端长度查 90+ 酶表；给定序列时报告双链向全部切点（IIS 酶的反向识别位点如 GAGACC 也会被切，这是 molbio_restriction_sites 不报告的）与片段大小

引物

工具	功能
`molbio_design_primers`	自动设计 PCR 引物对：Tm（SantaLucia 1998 NN，默认 50 mM Na⁺/1.5 mM Mg²⁺/200 nM，v13 起可用 `na_mm`/`mg_mm`/`dntp_mm`/`primer_nm` 调节）、GC、GC clamp（0-3 分级）、run/发夹/自互补/二聚体约束，按 amplicon 窗口配对并排序。v12 起结构筛查对齐 Primer3 模型：自互补为比对分（match +1/mismatch −1/gap −0.25，阈值 8.0/3.0），发夹与引物二聚体用同一套 NN 参数折成 Tm（默认 47 °C 阈值），3' 端稳定性（末 5 碱基 ΔG(37°C) ≤ 9 kcal/mol）与末 5 碱基 GC 数。v12 起支持错配容差：`max_mismatches > 0` 时允许引物与模板有少量错配（3' 末端碱基绝不错配、默认避开 3' 端关键区），每处错配在 `mismatches` 中报告并计入排序罚分，精确引物总是优先。`check_mispriming: true` 检查 3' 尾在模板上的非特异结合位点并拒绝/罚分。v13 起支持 3' 目标位置偏好：`target_position` + `target_penalty` 按"较近引物 3' 端到目标位点的距离"罚分排序（SNP/定点设计用），每对报告 `target_distance`
`molbio_design_intron_primers`	跨内含子 qPCR 引物（v10）：给定基因组序列 + 外显子坐标，正向引物跨外显子-外显子连接点（两侧各 ≥ min_junction_bases），反向引物位于另一外显子，基因组 DNA 无法扩增；`min_genomic_span` 强制最小基因组间距；输出剪接坐标 + 基因组坐标双套位置。v12 起支持错配容差（参数同 molbio_design_primers，错配在 spliced/genomic 双坐标下报告）。v13 起同样支持盐/浓度旋钮与 `target_position`（剪接坐标）
`molbio_primer_tm`	单条引物 Tm 估算（Na⁺/Mg²⁺/dNTP 盐校正，von Ahsen 2001）
`molbio_primer_check`	引物结构筛查：重复序列、自互补（3' 端加权）、发夹、引物对二聚体；v12 起增加 Primer3 同款热力学指标（self-any/self-end 比对分、发夹 Tm、二聚体 Tm、3' 端稳定性/GC）

质粒

工具	功能
`molbio_parse_snapgene`	SnapGene `.dna` 文件解析（研究者最常用的格式）：图谱名称、拓扑（环状/线形）、注释特征（类型/区段/链向/标签，支持多段 join 与 HTML 文本清洗）、序列、描述、accession、已保存引物
`molbio_plasmid_map_file`	一步成图：直接读 `.dna`（SnapGene）或 `.gb`/`.gbk`（GenBank）文件，把 SVG 图谱写入工作区文件并返回 `svg_path`（默认 `<名称>.svg`，可用 `output_path` 指定）；写入后自动用系统默认应用打开（`auto_view`，默认开启）
`molbio_parse_genbank`	GenBank flatfile 文本解析（complement/join 定位、/gene、/product 等）
`molbio_plasmid_map`	从序列 + 特征数组渲染并直接写入 SVG 文件（环形默认/线形可选）：特征分道、链向箭头、酶切标记、bp 刻度；同样返回 `svg_path` 并自动打开

克隆构建

工具	功能
`molbio_unique_cutters`	克隆选酶：载体单切 + 插入零切的"理想酶"列表（可限定 MCS 区间）、区间双切酶（片段切出）、排除切插入的酶
`molbio_clone_simulate`	酶切-连接（1-2 酶，`orientation=auto` 默认自动反向互补方向写反的插入片段）与 Gibson 组装（自动生成同源臂和 insert-to-order）模拟：输出最终质粒序列、特征坐标平移、连接点序列、验证酶切预测（对比空载体，单酶时含反向连接预测）；`save_path` 存 FASTA、`map_path` 一步写出新质粒图谱 SVG（含平移后的特征与验证酶标记）
`molbio_golden_gate`	v13 Golden Gate 组装：IIS 酶（BsaI 等）多片段组装模拟——自动设计唯一、非回文、非互补的 4 bp 突出端（载体已有盒子则读取、裸载体给 `replace_region` 则自动加盒子并设计两端突出端）、检查酶不切片段/裸载体、生成带识别位点的订购片段（fragments_to_order）、拼出最终质粒（连接处无酶切位点；载体盒子位点保留在骨架上，下一级组装换另一种 IIS 酶）、特征坐标平移与验证酶切；`save_path`/`map_path` 直接出 FASTA/SVG
`molbio_clone_primers`	扩增引物加尾：酶切位点 + 保护碱基（内置推荐表）或 Gibson 同源臂；自动复检全长 Tm（NN 估算）/GC/二聚体，并警告"酶也切模板内部"
`molbio_mutagenesis_primers`	QuickChange 式定点突变引物：支持 `A123G`/`123A>G`/`123_125del`/`after123insGCT`，突变居中、G/C 端、Tm/GC/结构复检，报告氨基酸变化（frame 1 假设）

克隆验证

工具	功能
`molbio_verify_sanger`	读 `.ab1`（ABIF 二进制：碱基 + 质量值）或 `.seq`/`.txt`/`.fasta` 测序文件 → 与参考质粒比对（环状感知，跨 origin 的读段也能对齐）→ 错配/缺失/插入报告（含质量标注）、同一性、CDS 内氨基酸后果（错义/沉默/移码）

实验与统计

工具	功能
`molbio_qpcr_analysis`	ΔΔCt 法：各组均值/SD、ΔCt、ΔΔCt、fold change（可设扩增效率）
`molbio_qpcr_efficiency`	稀释系列 → 标准曲线：斜率/截距/R²、扩增效率 E=10^(−1/slope)−1；`plot_path` 直接写出带拟合线的 SVG 标准曲线并自动打开
`molbio_plot`	通用 SVG 图表：柱状图（均值±SD 误差棒）与散点图（可选最小二乘拟合线），写成工作区文件并自动打开
`molbio_virtual_gel`	v13 虚拟琼脂糖凝胶：各泳道给出预期片段大小（酶切/PCR/连接检查）→ SVG 凝胶图 + 分子量 ladder（1kb/100bp），与真实胶对照；`output_path` 写工作区文件并自动打开
`molbio_lab_math`	稀释计算（C₁V₁=C₂V₂）、摩尔浓度、DNA 拷贝数

蛋白质

工具	功能
`molbio_protein_props`	MW（平均残基质量）、等电点（Bjellqvist 1993 pK）、A280 消光系数（还原/全二硫键两种）、A280(0.1%)、GRAVY（Kyte-Doolittle）、脂肪族指数（Ikai 1980）——均为估算
`molbio_peptide_digest`	质谱用酶切模拟：trypsin/chymotrypsin/LysC/GluC（P 前不切规则）、漏切 0-3、单同位素/平均 [M+H]+ 质量、质量范围过滤
`molbio_codon_optimize`	E. coli/酵母/人宿主密码子优化（公开发表的高频密码子表，启发式）；`avoid_enzymes` 通过同义替换尽量避开指定酶切位点

序列分析扩展

| 工具 | 功能 | | --- | --- | | molbio_align | Smith-Waterman 局部比对：可读的比对线（|/空格）、同一性%、比对区间、错配/缺失/插入列表 | | molbio_fasta_fastq | 工作区 FASTA/FASTQ 处理：条目统计（长度/GC）、按 id 提取（可写 FASTA）、FASTQ→FASTA 转换、FASTQ QC（Phred 均值/低质量比例/位点质量分布） | | molbio_extract_region | 从质粒文件按特征名（如 "AmpR"、"MCS"）或坐标提取子序列，可选反向互补与 FASTA 保存——克隆/设计的下游输入 |

多序列比对与保守性（v15）

工具功能

molbio_msa_align 多序列比对（v15）：2-50 条 IUPAC DNA 序列的渐进式比对——两两/谱-谱全局比对用带自由末端缺口的仿射罚分（match +4 / mismatch −4 / 缺口开 −6 / 延伸 −2），合并顺序来自 5-mer 距离 + UPGMA 引导树，"一旦有缺口、永远有缺口"；返回输入顺序的比对序列（sequences 数组或 fasta_path 工作区 FASTA）与两两同一性统计，save_path 直接写出比对后的 FASTA

molbio_conservation 保守性分析（v15）：共识序列（最高频碱基 ≥50% 直接给出，否则给出覆盖碱基的 IUPAC 简并码）、逐列 identity（最高频残基占比，缺口不计）、熵基保守性打分（1 − H/2）、保守/可变列统计（threshold 默认 0.8，可变位点列出至多 200 个；全缺口列计为保守）、两两同一性；输入可给 alignment（已比对等长序列，- 为缺口——如 molbio_msa_align 的输出）、sequences 或 fasta_path（后两者自动先比对）

工具	功能
`molbio_msa_align`	多序列比对（v15）：2-50 条 IUPAC DNA 序列的渐进式比对——两两/谱-谱全局比对用带自由末端缺口的仿射罚分（match +4 / mismatch −4 / 缺口开 −6 / 延伸 −2），合并顺序来自 5-mer 距离 + UPGMA 引导树，"一旦有缺口、永远有缺口"；返回输入顺序的比对序列（`sequences` 数组或 `fasta_path` 工作区 FASTA）与两两同一性统计，`save_path` 直接写出比对后的 FASTA
`molbio_conservation`	保守性分析（v15）：共识序列（最高频碱基 ≥50% 直接给出，否则给出覆盖碱基的 IUPAC 简并码）、逐列 identity（最高频残基占比，缺口不计）、熵基保守性打分（1 − H/2）、保守/可变列统计（`threshold` 默认 0.8，可变位点列出至多 200 个；全缺口列计为保守）、两两同一性；输入可给 `alignment`（已比对等长序列，`-` 为缺口——如 molbio_msa_align 的输出）、`sequences` 或 `fasta_path`（后两者自动先比对）

图谱增强

molbio_plasmid_map / molbio_plasmid_map_file 新增 gc_skew: true（GC skew 环）与 show_unique_cutters: true（绿色标记所有单切酶）

文献助手

工具	功能
`molbio_pubmed_search`	通过 harness 的 web 检索服务搜文献（自动提取 URL 中的 PMID）
`molbio_paper_add`	把文献加入阅读库（默认工作区 `papers.json`，按 PMID→URL→标题+年份去重）
`molbio_paper_list`	列出阅读库
`molbio_paper_update`	按 id 更新笔记/标签等字段
`molbio_paper_remove`	从阅读库删除一条文献

文献与记录

工具	功能
`molbio_pubmed_abstract`	NCBI E-utilities efetch 按 PMID 拉取摘要（依赖部署提供 web fetch 能力，不支持时明确报错）
`molbio_paper_export_bibtex`	papers.json → BibTeX `.bib` 文件（可选按 tag 过滤）
`molbio_protocol_add` / `protocol_list` / `protocol_update`	协议库（protocols.json）：步骤列表、自由参数对象、来源文献 id
`molbio_experiment_log` / `experiment_list`	实验日志（experiments.json）：关联协议与文献、笔记与结果

目录结构

dsh-molbio-tools/
├── index.mjs        # 插件入口：export { name, inject, apply }，注册 44 个工具
├── lib.mjs          # 基础库：IUPAC、翻译、酶表（含双链向切点查找）、NN 热力学、qPCR、lab math
├── design.mjs       # 引物自动设计（含跨内含子 qPCR）
├── genbank.mjs      # GenBank flatfile 解析器
├── snapgene.mjs     # SnapGene .dna 二进制解析器（含极简 XML 扫描器）
├── plasmid.mjs      # SVG 质粒图谱渲染器（环形/线形，GC skew/标记）
├── align.mjs        # Smith-Waterman 局部比对 + 锚点窗口（Sanger 验证用）
├── msa.mjs          # 多序列渐进式比对（仿射缺口 NW + UPGMA）与保守性分析
├── cloning.mjs      # 克隆模拟：选酶/酶切连接/Gibson/Golden Gate/克隆引物/突变引物
├── sanger.mjs       # ABIF (.ab1) 解析 + 测序验证报告
├── protein.mjs      # 蛋白性质/肽段酶切/密码子优化
├── plot.mjs         # SVG 柱状/散点图 + 虚拟琼脂糖凝胶渲染
├── seqio.mjs        # FASTA/FASTQ 解析与统计
├── records.mjs      # 协议库/实验日志存储
├── papers.mjs       # 文献库存储（经 harness fs 服务 + 沙箱政策）
├── view.mjs         # 自动查看：把生成的 SVG 交给系统默认应用打开（镜像 host.openPath 语义）
├── cordis.patch.yml # bundle 补丁层（可选安装渠道用，按包名插入 tool-molbio 行）
├── preset/
│   └── molbio-lab/  # 推荐的专属模式预设（agent.cordis.yml + preset.yml + plugins/dsh-molbio-tools-v15/）
├── test/
│   └── smoke.mjs    # 冒烟测试（复用 harness 自身的 JSON Schema 校验器）
├── docs/
│   └── maintainer.md # 维护者文档（合规对照/开发测试/路线图）
├── package.json
└── README.md

安装（推荐：专属模式 preset）

推荐给最终用户的方式：安装后预设选择器出现 Molecular Biology Lab 专属模式， molbio 工具只在该模式出现，不会把 44 个工具和提示段注入到其它会话（避免污染无关场景）。

仓库的 preset/molbio-lab/ 即完整预设目录，把它复制到对方的 harness 用户目录即可：

~/.dsh/.agent-presets/molbio-lab/
├── agent.cordis.yml                 # 标准编码 Agent + 末尾的 tool-molbio 行
├── preset.yml                       # 显示名称与描述
└── plugins/
    └── dsh-molbio-tools-v15/        # 插件文件（版本目录，见下文）

对方重启（或刷新预设列表）后，在预设选择器中选择 Molecular Biology Lab 新建会话。

插件更新（版本目录规则）

DSH 的 standing 挂载按 ESM 模块 URL 缓存模块。每次更新必须新建版本目录 （如 dsh-molbio-tools-v15/）并同步修改 agent.cordis.yml 中的插件行；绝不在已发布目录里原地改文件。分发者从包根目录把 .mjs 文件复制进新版本目录即可：

cp *.mjs preset/molbio-lab/plugins/dsh-molbio-tools-v15/
# 并把 agent.cordis.yml 的行改为 './plugins/dsh-molbio-tools-v15/index.mjs'

安装（可选：官方组合包 bundle，全局可见）

本包同时是官方的组合包（bundle）（dsh.bundle manifest → cordis.patch.yml）。注意：bundle 把插件行注册到 profile 的全局 tools 层——该 profile 的所有会话都会加载 molbio 工具与提示段。适合"整个 profile 专用于分子生物学"的用户，不适合混合用途。

方式	命令	用户安装
GitHub	推送到仓库	`dsh plugin --profile <name> add github:lovy2004/dsh-molbio-tools`（纯 JS 零构建，无需 prepare 脚本与构建授权）
npm 发布	`npm publish`	`dsh plugin --profile <name> add dsh-molbio-tools`
tarball	`pnpm pack`	`dsh plugin --profile <name> add ./dsh-molbio-tools-0.1.0.tgz`

验证方式（官方推荐）：

dsh plugin --profile demo add <包>      # 需要用户机器装有 pnpm（官方流程依赖）
dsh --profile demo --dump-config        # 组合树中应出现 "# == dsh-molbio-tools" 层

本仓库已验证：--dump-config 输出以 # == dsh-molbio-tools + - id: tool-molbio / name: dsh-molbio-tools 开头（层序在 dsh-base 之上），且从 profile 目录按包名 import('dsh-molbio-tools') 成功注册全部 39 个工具。两种安装方式可以共存（同名工具由 preset 层 shadow 全局层，无冲突），但通常二选一即可。

> 版本目录规则的原理（维护者必读）：DSH 的 standing preset 挂载在整个进程生命周期 > 内存在，且 Node 的 ESM 模块缓存以文件 URL 为键——同一 URL 的 import() 永远返回 > 第一次加载的模块，包括插件内部的相互 import（给入口加查询串只能破坏入口自身的 > 缓存，依赖文件仍会命中旧缓存）。因此原地替换 .mjs 不会让新会话加载新代码；目录名 > 变化使所有模块 URL 一次性更新。旧目录可删除（已运行的 generation 持有内存中的模块， > 不受磁盘删除影响）。

行为与假设

纯计算工具（序列/引物/统计）确定性、无副作用；输入输出均为可持久化的 JSON。
图谱工具直接写文件：molbio_plasmid_map / molbio_plasmid_map_file 把 SVG 写入工作区（ctx.fs + 会话沙箱政策），模型上下文里只出现文件路径，避免大文本截断。
自动查看（auto-view）：所有生成图片的工具（molbio_plasmid_map、molbio_plasmid_map_file、molbio_clone_simulate/molbio_golden_gate 的 map_path、molbio_qpcr_efficiency 的 plot_path、molbio_plot、molbio_virtual_gel）写完 SVG 后自动用操作系统默认应用打开（Windows 为 Invoke-Item、macOS 为 open、桌面 Linux 为 xdg-open/$BROWSER、WSL 自动转译为 Windows 路径），结果中的 auto_viewed 字段报告交接是否成功。每调用可用 auto_view: false 关闭；无桌面环境（headless Linux）与 MOLBIO_AUTO_VIEW=0 时自动跳过。
克隆模拟约定：酶切-连接要求"插入片段按 5'→3' 书写、上游酶在 5' 端"；单酶连接会给出双向连接说明与两种方向的验证酶切；特征坐标按插入/缺失自动平移，跨越连接点的特征标注 spans_insertion。
Sanger 验证：参考序列按环状处理（读段跨 origin 也能正确对齐）；.ab1 低质量（<20）位点单独标注且不计入"differences_found"判定；氨基酸后果按 frame 1 假设报告。
文献库与检索走 harness 的 fs/web 服务：库文件默认 papers.json 在工作区内，写入遵循会话的沙箱政策（ctx.sandboxPolicy），与其他文件工具同权。
IUPAC 序列：输入支持 A C G T U R Y S W K M B D H V N；U 按 T 处理；简并碱基在酶切位点匹配与引物设计中视为不匹配/不可用。
Tm 是估算值：SantaLucia 1998 NN + 盐校正，报告时应说明是估算，不能替代仪器校准。
图谱坐标：特征 1-based 闭区间；strand: -1 表示 complement 链；酶切标记使用酶表的标准切点记号。
引物设计性能：区域扫描 + 候选缓存 + 排序裁剪，几十 kb 模板在亚秒级完成；找不到满足约束的组合时返回空并提示放宽条件。
错配容差（v12）：max_mismatches > 0 时，若某窗口没有精确引物通过全部约束，设计器用最少的替换尝试挽救（只针对可修复的约束：GC 失衡、run、Tm 微差）。3' 末端碱基永远不错配，默认在 3' 端 mismatch_3prime_zone（默认 5 bp）关键区内也不放错配（max_3prime_mismatches 可放宽）。每处错配逐条报告：引物内位置、模板位置、模板碱基/引物碱基、距 3' 端距离；每个错配都会加重排序罚分——存在精确引物时精确引物永远优先。
Primer3 对齐的结构筛查（v12）：自互补（self-any/self-end）为比对分（match +1 / mismatch −1 / gap −0.25，阈值 8.0/3.0）；发夹与引物二聚体（any/end）用与 Tm 相同的 SantaLucia NN 参数折成 Tm（默认阈值 47 °C，max_hairpin_tm/max_dimer_tm/max_dimer_end_tm）；3' 端稳定性 = 末 5 碱基的 ΔG(37 °C)（max_end_stability，默认 9 kcal/mol）；末 5 碱基 GC 数（max_end_gc，默认 5）；GC clamp 为 0-3 连续 G/C 分级（gc_clamp，默认 1，require_gc_clamp 为兼容别名）。数值均为估算，与 Primer3 同量纲便于互相校验。
非特异结合检查（v12）：check_mispriming: true 时，按 k-mer 索引检查每条引物 3' 尾（默认 8 bp、允许 1 个错配且末端碱基必须配对）在模板双链上的额外退火位点；超过 mispriming_max_sites 的引物对被拒绝，其余按位点数罚分并在 mispriming_sites 中报告位点与链向。
反应条件旋钮（v13）：两个设计工具暴露 na_mm/mg_mm/dntp_mm/primer_nm（默认 50/1.5/0.8/200，与 README 旧版固定值一致），直接驱动 Tm 模型的 von Ahsen 2001 盐校正与发夹/二聚体折叠浓度；输出 conditions 回显实际使用的条件。
3' 目标位置偏好（v13）：target_position（模板坐标，跨内含子设计为剪接坐标）+ target_penalty 按"较近引物 3' 端到目标的距离"加重排序罚分，用于 SNP 分型/定点设计；每对与每条引物报告 target_distance。无目标时该字段不出现。
酶目录与双链向切点（v13）：molbio_enzyme_lookup 报告 IIS 酶在反向识别位点（如 BsaI 对 GAGACC）的切点——这是 molbio_restriction_sites 不报告的；molbio_golden_gate 的内部位点检查同样按双链向。
Golden Gate（v13）：molbio_golden_gate 按标准 BsaI 类几何建模（识别位点 + filler + 4 bp 5' 突出端）：连接处不留识别位点，载体盒子的两个识别位点保留在骨架上（标准 destination 载体行为，下一级组装换另一种 IIS 酶）；输出质粒与特征坐标以反向切点为线性化起点（环状质粒，仅显示原点不同），fragments_to_order 给出可直接下单的片段序列。突出端设计确定性（按 |GC−2| 排序的 4-mer 池贪心选取），唯一、非回文、非互补，并回溯验证连接处不重建酶位点。
虚拟凝胶（v13）：molbio_virtual_gel 用 log₁₀ 迁移率模型绘制预期条带（2 + 2·log₁₀(bp) 条带粗细），是"预期图"而非真实胶的模拟。
多序列比对（v15）：molbio_msa_align 是启发式渐进比对——两两/谱比对用仿射缺口（开 −6/延伸 −2，match +4/mismatch −4）且末端缺口免费（半全局），合并顺序由 5-mer 距离的 UPGMA 树决定，谱-谱打分用和-对（sum-of-pairs，按列碱基计数，残基对缺口计 0 分）；合并时新缺口按"一旦有缺口、永远有缺口"整列延伸，末端悬挂则允许部分缺口列。输入限制 2-50 条、单条 ≤ 3000 bp、总长 ≤ 30000 bp；U 按 T 处理，简并碱基相同才计匹配（R vs A 不计）。输出顺序与输入一致。
保守性分析（v15）：列 identity = 最高频残基数/该列残基数（缺口不计入残基）；熵基保守性 = 1 − H/2（H 为 4 碱基分布（简并碱基按集合展开）的香农熵）；共识字符 = 最高频碱基（占比 ≥50%）否则为出现碱基集合的 IUPAC 简并码；全缺口列共识为 - 且计为保守。threshold（默认 0.8）以下列为可变位点（至多报告 200 个）；两两同一性 = 相同非缺口列/总列数（两个缺口不算匹配）。≤300 列时逐列详情附于 per_column。所有比对与打分均为用于比较的估算值，不是系统发育真值。

典型用法示例

"解析这个 .dna 文件并画出质粒图谱"        → molbio_plasmid_map_file(path, enzymes:[...]) → 工具直接写入 <名称>.svg
"看看 pUC118.dna 里有哪些特征和引物"      → molbio_parse_snapgene(path)
"把这段序列克隆进 pUC118（EcoRI/HindIII），模拟最终质粒" → molbio_unique_cutters 选酶 → molbio_clone_simulate → molbio_plasmid_map 画新质粒
"用 BsaI 把三个片段 Golden Gate 装进 pL1" → molbio_golden_gate(vector, inserts:[...], replace_region:{...}) → fragments_to_order 下单 + save_path/map_path
"我的载体里 BsaI 会不会把插入片段切了？" → molbio_enzyme_lookup(sequence: 片段, enzymes:[BsaI])
"酶切应该出哪几条带？画个图" → molbio_restriction_sites → molbio_virtual_gel(lanes:[{fragments}])
"给插入片段设计带酶切位点的克隆引物"      → molbio_clone_primers
"帮我验证这个测序结果和质粒是否一致"      → molbio_verify_sanger(trace_path, reference_path)
"帮我在外显子 3 上设计一对 qPCR 引物，产物 80-150 bp" → molbio_design_primers (amplicon_min/max) → molbio_primer_check 复核
"把这几条同源序列对齐，找出保守区和可变位点" → molbio_msa_align(sequences:[…]) → molbio_conservation(alignment: 比对结果) 或直接 molbio_conservation(sequences:[…])
"搜一下 KRAS G12D 抑制剂的最新文献并存进阅读库" → molbio_pubmed_search → molbio_paper_add

SnapGene .dna 支持说明

解析器支持现代 SnapGene 格式（cookie + DNA 包 + XML 包：features 0x0A、primers 0x05、notes 0x06）；序列编码自动检测（ASCII 与旧式数字编码）；环状/线形由 DNA 包 flags 推断。
特征区段支持多段 join（如 AmpR 的编码区 + 信号肽），directionality 映射为链向（1→正链，2→负链）。
SnapGene 注释里的 HTML 文本（<html>…）会自动清洗为纯文本。
.dna 是二进制文件，普通 read 工具读不了——请直接给工具传文件路径，不要尝试自己读内容。

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维护者（开发者）请参阅 [docs/maintainer.md](docs/maintainer.md)：官方规范对照、冒烟测试与发布/版本目录维护流程。